一篇小文帶您玩轉(zhuǎn)顯微觀察方式

作者：時(shí)間：2017/3/20 9:06:21

顯微鏡作為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備，每天可見(jiàn)，其應(yīng)用也非常廣泛。小到微生物檢測(cè)，大到產(chǎn)品的外觀檢查，覆蓋了各個(gè)方面。可是，對(duì)于不同的顯微觀察方式，您真的了解嗎？在這篇小文中，我們就簡(jiǎn)單扒一扒不同顯微觀察方式、優(yōu)缺點(diǎn)及各自的應(yīng)用范圍。

1.明場(chǎng) BF

作為最常規(guī)的觀察方式，明場(chǎng)的應(yīng)用主要在于常規(guī)的鏡檢、組織、病理切片或者各類(lèi)染色標(biāo)本的觀察。生物學(xué)專(zhuān)業(yè)的童鞋最熟悉的革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的觀察，以及顯微計(jì)數(shù)等，都離不開(kāi)這種觀察方式。

明場(chǎng)觀察的優(yōu)點(diǎn)是視野的亮度高、均勻；而且操作簡(jiǎn)單，成本不高。是非常受歡迎的一類(lèi)觀察方式。但同時(shí)也存在一些缺點(diǎn)，比如需要制片；物鏡工作距離短無(wú)法觀察較厚的樣本等問(wèn)題。另外，如果是透明標(biāo)本，對(duì)比度較低，細(xì)節(jié)不易呈現(xiàn)。當(dāng)然，這種觀察方式也看不到樣本的立體結(jié)構(gòu)。

2.暗場(chǎng) DF

它的特點(diǎn)和明場(chǎng)不同，不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此，視場(chǎng)成為黑暗的背景，而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的像。一般用于微小粒子、細(xì)菌形態(tài)、透明標(biāo)本等的觀察。能夠觀察到極其微小的物體，其分辨率可達(dá)0.4um，反差大。

這種觀察方式不太多見(jiàn)，只能觀察到物體存在、運(yùn)動(dòng)和外部形態(tài)等，對(duì)標(biāo)本的要求也比較高。

3.相差觀察 PH

利用被檢物體的光程差進(jìn)行鏡檢，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹睢？捎糜诨铙w細(xì)胞觀察、無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)等。一般配置在倒置顯微鏡上，是鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法。可使細(xì)胞樣本產(chǎn)生一些立體感。

但是，這種觀察方式需要的光強(qiáng)較高，且切片不能太厚，需要控制在5~10um。操作有點(diǎn)麻煩，熒光效果不如明場(chǎng)物鏡。在高倍下會(huì)產(chǎn)生光暈，影響成像效果。

4.偏光觀察 POL

偏光觀察的原理是依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù)，以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)。這種觀察方式成像一般非常漂亮。

但僅適用于具有雙折射性的物質(zhì)，比如礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別；鑒別纖維、染色體、淀粉粒、晶體；植物病理檢驗(yàn)、骨骼、牙齒；膽固醇、神經(jīng)纖維、以及毛發(fā)等。

5.微光干涉 DIC

微分干涉原理是通過(guò)特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束在極近的兩點(diǎn)（小于顯微鏡的分辨率）上通過(guò)被檢物體，從而在相位上略有差別，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺(jué)。這種觀察方式最直接的效果就是產(chǎn)生立體感。可應(yīng)用于觀察無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，立體感好、分辨率高

無(wú)色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本成像，以及用于顯微操作等。

其缺點(diǎn)是需要的光強(qiáng)較高，雙折射物質(zhì)不能做DIC鏡檢。細(xì)胞培養(yǎng)客戶最關(guān)心的細(xì)胞觀察，需要使用底部為玻璃的器皿進(jìn)行DIC觀察。

6.浮雕相稱(chēng) IMC

IMC觀察的原理比較簡(jiǎn)單，利用斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過(guò)物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異，增加觀察對(duì)比度。這種觀察方式經(jīng)濟(jì)實(shí)用，不限被觀察樣本的材質(zhì)，可用于塑料皿的觀察，調(diào)節(jié)也很方便。

可以用于胞質(zhì)內(nèi)精子注、IVF和細(xì)胞觀察。

成像特點(diǎn)是圖像顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈。可用于雙折射物質(zhì)的檢測(cè)，也可用于檢測(cè)玻璃、塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，但分辨率不如DIC高。同時(shí)Leica專(zhuān)利的物鏡可同時(shí)用于明場(chǎng)、暗場(chǎng)和熒光觀察，使用方便。

7.熒光觀察

什么是熒光呢？熒光就是物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。

顯微鏡下的熒光觀察也是比較常用的觀察方式。生物學(xué)中的熒光探針有三種類(lèi)型：自發(fā)熒光、熒光染料以及熒光蛋白。其中自發(fā)熒光一般是天然的，無(wú)法控制，通常是令人討厭的。熒光染料明亮且光譜范圍大，相對(duì)穩(wěn)定，應(yīng)用范圍較寬，但是用于特異性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)比較困難；熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)包括通過(guò)融合目標(biāo)蛋白可以在活細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；可以作為結(jié)構(gòu)破壞的靶；對(duì)一些環(huán)境參數(shù)敏感；缺點(diǎn)是波長(zhǎng)選擇有限，低光穩(wěn)定性，光譜交叉，基團(tuán)相對(duì)龐大等。

熒光探針通常被應(yīng)用于定位、研究蛋白間相互作用、空間結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞環(huán)境報(bào)道、基因表達(dá)報(bào)道等。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)的客戶，熒光通常用于染色區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)成分染色等。